篇一：水煮法灵敏度分析
花青素检测内容和方法
花青素（Anthocyanins）是一类广泛存在于植物中的天然色素，具有丰富的抗氧化和抗炎特性。以下是关于花青素检测的50条内容和方法：
1.花青素的检测可以通过分光光度法进行，该方法通过测量样品吸收特定波长的光来确定花青素的含量。
2.除了分光光度法，高效液相色谱法（HPLC）也是一种常用的花青素检测方法，可以准确测量不同类型的花青素。
3.在花青素检测中，常用的溶剂包括甲醇、乙腈和水，这些溶剂可以帮助提取样品中的花青素。
4.还可以使用质谱法（MS）结合色谱法进行花青素的鉴定和定量分析，能够提高检测的精准度和准确性。
5.花青素的含量可以通过比色法进行测定，该方法通过添加试剂产生有色产物来测量花青素的浓度。
6.采用高性能液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）可以对花青素进行定性和定量分析，具有高灵敏度和选择性。
7.使用紫外-可见分光光度法（UV-Vis）可测定花青素的吸光度，从而推算花青素的浓度。
8.考虑到植物样品中可能存在其他干扰物质，需要对样品进行预处理，如蛋白质去除和净化，以提高花青素的检测灵敏度和准确性。
9.对于不同环境下的花青素含量变化调查，可以通过原子吸收光谱分析（AAS）确定植物中金属离子对花青素生成的影响。
10.考虑到花青素的稳定性，检测前样品处理和存储条件至关重要，如低温保存、光照避免、氧气隔离等。
11.比较两个或多个样品中花青素的含量，可以通过内标法（Internalstandardmethod）进行定量，以减小实验误差。
12.回收率试验可以通过添加已知浓度的花青素作为标准品，验证提取方法的效果和准确性。
13.花青素的结构分析可以使用质谱联用色谱技术（LC-MS）进行，以确定不同花青素的分子结构和质量。
14.对于不同类型的花青素，还可以使用凝胶层析法（GelFiltrationChromatography）进行分离和检测。
15.非离子表面活性剂（Non-ionicsurfactants）可以在样品制备中用来改善花青素的提取率和稳定性。
16.对不同植物的花青素含量进行比较时，需要考虑到不同植物组织中花青素含量的差异，如果实、叶片、花朵等。
17.对于红酒、浆果和蔬菜等食品中的花青素含量检测，可以采用色素提取法和定量法。
18.采用高效液相色谱法可以分离不同类型花青素，测定其各自的含量，并能辅助鉴定其结构。
19.高性能液相色谱法（HPLC）联用二极管阵列检测器（DAD）可以同时测定植物样品中多种花青素的含量和结构。
20.通过酶联免疫吸附法（ELISA）也能对花青素进行定量分析，具有灵敏度高、操作简便的特点。
21.对于浆果等高水分植物中花青素的含量检测，可以采用冷冻干燥技术进行样品处理。
22.采用薄层色谱法（TLC）可以初步鉴定花青素的类型和含量，并与其他方法相结合进行验证。
23.常规的分离技术，如萃取、凝胶过滤、分离柱层析等，能够提高植物样品中花青素的提取与分离效果。
24.使用不同波长下的吸收光度法进行花青素的检测可以得到花青素的波长最大吸光度和摩尔吸光系数。
25.通过气相色谱法（GC）结合质谱法（MS）可以对花青素的挥发性成分及其结构进行分析。
26.对于植物细胞组分中的花青素含量测定，可以采用荧光光度法进行分析。
27.通过对植物细胞内不同部位的分离提取，可以测定不同部位的花青素含量，比如胞核、细胞质等。
28.对于受到环境胁迫的植物，通过测定其花青素含量变化，可以评估其抗逆性。
29.利用高效液相色谱联用矮式调制电位检测器（HPLC-MS/AD）可以定量和鉴定植物样品中的花青素。
30.对于有机花青素，利用核磁共振技术（NMR）可以对其结构进行鉴定和表征。
31.通过对植物不同生长阶段中花青素含量的动态调查，可以了解花青素在植物生长发育过程中的变化规律。
32.采用高速离心技术可以加速植物样品中花青素的提取和分离效果，提高检测效率。
33.通过对不同植物品种花青素含量的测定，可以评估不同品种植物中花青素的差异性。
34.使用微波辅助提取技术可以提高花青素的提取效率，缩短分析时间，并减小溶剂的使用量。
35.采用固相萃取技术可以对花青素进行分离纯化，减小复杂基质的干扰，提高分析准确性。
36.通过对植物不同品种或不同生长期的花青素进行测定，可以了解其生物活性的差异。
37.利用电化学法检测花青素也是一种常用方法，可以实现对花青素的快速、灵敏的检测。
38.采用标准曲线法进行花青素的定量测定可以得到较为准确的含量数据，为后续分析提供参考。
39.对于水果中花青素的检测，可以根据水果的不同性质选择合适的提取方法，如水煮提取、酒精提取等。
40.通过对不同地域或生长环境下植物中花青素含量的测定，可以评估环境对花青素产量的影响。
41.利用固定相色谱法也可以进行花青素的分离与检测，通过不同成分在固定相上的滞留时间进行分析。
42.采用微波消解技术可以提高植物样品中花青素的提取率，并能够更好地保存花青素的结构完整性。
43.对于不同pH值的花青素提取溶剂的选择会影响花青素的提取效果，需事先进行实验确定最适宜的提取条件。
44.通过对花青素的荧光检测可以实现对花青素的快速、高效的检测，适用于高通量检测。
45.采用固相微萃取技术也是一种高效的花青素提取方法，能够降低溶剂的使用量和提高提取效率。
46.通过对植物不同部位的花青素含量进行测定，可了解不同部位对植物营养生长的贡献。
47.对于植物中与花青素结合的金属离子，可以采用原子荧光光谱法（AFS）进行测定，以验证其影响。
48.通过对花青素的光敏性测试，可以评估光照条件对花青素稳定性的影响。
49.采用石英管柱高效液相色谱法可以实现对花青素的高效分离和检测，提高分析效率和准确性。
50.对花青素的检测结果需进行统计分析，比较不同样品的含量差异的显著性，并进行结果的可靠性验证。
篇二：水煮法灵敏度分析
在线稀释技术的原理及应用介绍
液相色谱的饭量？是指进样量吗？液相色谱进样量不是20μL吗？还用问？是的客官，题目问的就是“液相色谱的进样量能有多大？”但是，这个问题是不严谨的。因为问这样的问题就相当于问“人的饭量有多大”一样，没有答案——人的饭量跟详细某个人的身材、身体状况、喜不喜爱吃米饭有关，还跟这碗米饭怎么煮有关：一勺子没加水的干米可以噎死人，一比一加水煮成的饭能吃两碗，一比九对水煮成的稀饭吃三、四碗没问题。
那对于液相色谱来说，进样量除了跟色谱柱的尺寸、柱效、目标物与色谱柱的匹配度、梯度初始比例有关，也跟样品怎么“煮”成的有关：以反相色谱为例，100%有机相(强溶剂=干米)，50%有机相(弱溶剂=水，50%有机相=饭)和10%有机相(稀饭)的进样量是不一样的！
相同色谱柱，进样溶剂不同，允许进样量不同的根本原因是溶剂效应：溶剂效应本质是大体积的强溶剂携带着目标物进到色谱柱后将取代流淌相形成一个独立的液段，这一液段对目标物有很强的携带能力，且强溶剂液段在色谱柱中几乎没有保留，最终目标物被强溶剂拖带拉宽，形成很长的前延峰，甚至有一部分目标物被强溶剂脱裂跟随其一起在死时间出峰(图1A)。
假如有一个方法，可以把强溶剂快速稀释成弱溶剂，是不是可以提高进样量？
岛津设计了一种新的在线稀释技术，其原理如图1B，配置
如图2：
图1.在线稀释技术的原理图2.在线稀释技术仪器配置
在线稀释技术将强溶剂与高比例的弱溶剂通过高效混合器瞬间稀释成一个90-95%的弱溶剂，再注入到色谱柱，因为弱溶剂无法推动目标物往前移动，此时目标物将在柱头聚焦，待目标物全部聚焦在柱头，再提高强溶剂比例，使分析物分别得到尖锐对称的色谱峰。
那这个快速煮粥技术……不，这高大上的在线稀释技术有什么用？
1、在线稀释技术的应用
1——
大体积水的直接进样
在线稀释技术最初被应用在大体积水样的直接进样分析中：大部分的平凡液相色谱柱是不允许100%水样直接进样的，因为其硅胶基质简单被水解离形成不可逆损坏。使用在线稀释技术可以在大体积水进样的同时加入小比例的有机相(5%或10%)，使其在线形成液相色谱可接受的进样溶剂。图2为1mL水直接进样分析十种抗生素得到的色谱图，全程自动化运行，灵敏度高、精密度好。
图3.大体积进样在线分析系统用于水中抗生素的直接检测
2、在线稀释技术的应用
2——
大体积有机相的直接进样
大部分的样品前处理都包括强溶剂的萃取或强溶剂的洗脱定容为终结——因为强溶剂对目标物的溶解度高。然而大体积的强溶剂直接进样很简单噎死色谱柱。用我们的在线稀释技术可以完美解决：利用在线稀释大体积分析系统直接进样分析200μL乙腈白菜提取液中24种农残，得到色谱峰尖锐对称，方法精
密度优异，灵敏度大大提高。图4为本系统与平凡超高效液相色谱系统的谱图对比，可见左图200μL进样溶剂在平凡超高效液相色谱系统有特别严重的溶剂效应，而在右图在线稀释大体积系统中峰型尖锐对称，灵敏度大大提高。
图4.大体积进样分析系统用于白菜中多种农残的高灵敏检测；QishengZhong,etal.JournalofChromatographyA,2016,1442,53-613、在线稀释技术的应用
3——
双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS
大体积进样量有可能会带来一个问题，即基质杂质增加，影响定量精确
度。固相萃取SPE是一种有效的样品富集和除杂手段，广泛应用于食品、环境或生物样品的前处理。但手工操作的离线SPE存在操作繁琐复杂、耗时、重现性差等缺点，而在线SPE-HPLC可以部分解决以上问题。
目前的在线SPE-HPLC系统一般分为两步进行，第一步是富集+除杂质，第二步是解吸+分别。见图5所示。该系统通常由两个流路连接一个六通阀组成，萃取柱连接在六通阀上。第一个流路(虚线部分)是提取和富集，另一个流路(实线部分)是样品的解吸和高效液相色谱分别。分析开头时，样品由自动进样器导入，随后被液相泵推动通过SPE柱完成目标物的富集(弱保留杂质流经SPE柱而无保留)。然后切换阀门，SPE柱被切换到两个色谱泵和色谱柱之间，流淌相A和B兼任解吸液，将目标物从SPE柱上解析下来并随后进入色谱柱进行分别分析。
图5.在线SPE系统常见的配置和流路构造
然而，这个系统有几个缺点：首先解吸分别步骤中，SPE柱连在两个泵和色谱柱之间，这意味着只能耐受常压的SPE柱要承受和高效液相色谱柱相同的压力；其次，假如使用与这个SPE柱相匹配的常规色谱柱，通常直径为4.6mm，最优流量为1mL/min，超出了ESI源离子化承载的流量，因此需要通过降低流速或柱后分流等手段削减ESI负荷，最终导致方法灵敏度下降；第三，流淌相A和B兼任解吸液和分别溶液，在大多数状况下，最佳解吸溶液与最佳流淌相不是同种溶液，最终导致解吸效率下降或峰展宽；最终，样品为生物样品或高比例强溶剂萃取液时，在进样前需要用弱溶剂离线稀释，虽然离线稀释即耗时又间接减小了进样浓度，但特别有必要：一是将目标化合物与基质脱附(如药物与蛋白质的脱附)；二，将高比例强溶剂稀释为高比例弱溶剂，以提高过柱过程中在萃取柱上的保留。
为解决以上缺点，岛津设计了双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统，其配置和流路设计见图6。
图6.双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统的硬件配置和流路设计；专利号CN103940941B
这个系统有三个分析步骤：
(1)第一步是样品的稀释和提取。样品通过自动进样器直接注入系统，通过泵D稀释溶剂推送进入高效混合器1，样品被在线稀释为弱溶剂。然后稀释液加载到固相萃取柱完成目标物的富集及杂质的去除。
(2)当富集除杂完成后，切换阀1，进行目标物的解吸和捕获。在这一步中，泵C推送最优的解吸液到固相萃取柱，目标
物被解吸液解吸并移动经过500μL定量环，调整分析方法至绝大部分目标物捕集到定量环1中，切换定量阀进入第三步。
(3)第三步是解吸液的柱前稀释，以及进行超高压的样品分别分析。柱前稀释的原理即为此前提到在线稀释，可即时将解吸液稀释为90%以上的弱溶剂，然后才进入超高压液相色谱柱。此时弱溶剂完全没有洗脱能力，因此目标物将在色谱柱头进行聚焦。之后转变有机相比例，实现梯度洗脱，得到尖锐的色谱峰形。在此过程中实现了解吸液的柱前稀释、超高压的色谱分别。此时超高压色谱柱使用的是最优流速，且无需分流，与质谱完美匹配，提高分析的灵敏度。
该在线系统相对于平凡SPE-HPLC系统有以下优点：
(1)实现萃取前样品的在线稀释，免除离线稀释的手工误差；
(2)破除分别色谱柱的局限性，可以使用UHPLC高压柱，分别条件与SPE萃取条件相互独立，与ESI质谱相匹配；
(3)独立解吸泵推送解吸液：可以使用最优解吸条件，并具有解吸效率最高，解吸时间最短，解析液体积最小等优点；
(4)解吸溶剂的截获&切换：在解吸条件最优的条件下，使用500μL定量环(可随SPE尺寸调整)，确保解析液全部被截获；定量环还起到压力过度作用，SPE柱不与UHPCL柱串联，全程处于低压状态；
(5)大体积解吸溶液的在线稀释，实现柱头聚焦和有效UHPLC分别。
我们用这个系统先后应用于植物提取液中三种植物激素和血浆样品中十种抗精神病药的直接检测，得到了满足的结果：
(1)双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于植物提取液中植物激素的直接检测
图7.双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于植物提取液中三种植物激素的直接检测；QishengZhong,etal.JournalofChromatographyA,2014.1359:131-139.
(2)双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于血浆中十种抗精神病药的直接检测
图8.双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于血清中十种抗精神病药的直接检测；
QishengZhong,etal.JournalofSeparationScience,2016,0,1-9.
由以上应用实例我们可以看到，使用岛津独有的在线稀释技术，可以大大提超群液相色谱的饭量，不但能提高灵敏度，而且能够应用在在线分析系统，实现目标物的富集和杂质去除，得到满足的分析结果。
篇三：水煮法灵敏度分析
白芍、赤芍的研究综述
【摘要】芍药经过历代医家的不断实践，已经形成了较为稳定的用法。但是，在白芍与赤芍区分方面仍有不甚明晰之处。通过查阅文献从来源、化学成分、药理作用及临床应用等方面对之加以区别。两者都含有芍药苷，本文将介绍一些关于芍药苷的现代分析方法。
【关键词】
白芍、赤芍、芍药苷、化学成分、药理作用、分析方法
1、来源与加工的区别
白芍为毛莨科植物芍药Paeonialactiflora·Pall的去外皮干燥根,性微寒,味苦酸。归肝脾经。主产于浙江、安徽、四川、山东、湖南等地。夏、秋采挖已栽植3～4年的芍药根,除去根茎及须根,洗净,刮去粗皮,置于沸水中略煮,使芍根发软,捞出晒干。以根粗、坚实、无白心或裂隙者为佳。
赤芍为毛茛科植物芍药Paeonialactiflora·Pall或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根,性味苦、微寒,归肝经。赤芍主产于内蒙古、河北、东北等省区；陕西、甘肃、宁夏、山西亦产。川赤芍主产于四川；甘肃、陕西、青海亦有分布。夏、秋两季采挖,除去根
头及须根,晒干。以条粗长、断面粉白色、【3】
粉性大者为佳。
结合上述，白芍与赤芍的主要不同点在于白芍主产于南方，炮制过程要去粗皮，水煮后晾干。而赤芍主产于北方，炮制是采挖后可直接晾干，无需水煮。并且在来源上赤芍比白芍来源广泛些，赤芍也可取自川赤芍的根。现常将芍药栽培品的根作为白芍入药,而其野生及其它种芍药皆作为赤芍入药。
2、化学成分的区别
白芍主要含有芍药苷(paeoniflorin)1.86%～5.76%、羟基芍药苷(oxypaeoniflorin)、芍药内酯苷(albiflorin)、苯甲酰羟基芍药苷（benzoyloxypaeoniflorin)、苯甲酸、鞣质、没食子酸。
赤芍含有丰富的苷类化合物,主要含有芍药苷3.5%～7.98%,羟基芍药苷0.12%～0.21%、芍药内酯苷，苯甲酰羟基芍药苷，苯甲酰芍药苷(benzoylpaeoniflorin)，此外还含有没食子酸、苯甲酸、鞣质。
二者所含的化学成分大致相同，但是含量各异，差别较大，有文献报道赤芍中芍药苷的含量大6.4%。D-儿茶精的含量高于0.05%,没食子酸的含量(除黄龙外)小于0.05%,苯甲酸含量低于0.21%。白芍中没有检测到D-儿茶精,芍药苷的含量小于6.0%,没食子酸的含量大于0.07%,苯甲酸含量低于0.15%。
3、药理作用和临床应用的区别
白芍中医记载具有养血柔肝,缓中止痛,行瘀、凉血、消肿及敛阴收汗之功效。现代中药药理研究表明它具有解除腹部痉挛
作用，对胃、肠管、子宫平滑肌均有抑制或解痉作用；并有解热，镇痛，镇静和抗惊厥的作用；还有抗炎，抗溃疡和对多种致病菌及某些病毒有抑制作用等。临床多用于阴虚发热、自汗盗汗，主治头晕、头痛、胸胁疼痛、痢疾腹痛、阑尾炎腹痛、腓肠肌痉挛、痛经和月经不调等症。白芍因其药理作用广泛，临床上多与其它药配伍使用。除上述治疗作用外，用于治疗糖尿病、哮喘、胃及十二指肠溃疡、习惯性便秘、肌肉痉挛及各种痛症，均取得良好疗效。
赤芍中医中记载有清热凉血、散瘀止痛之功能。现代药理作用研究证明其具有抑制血小板和红细胞聚集、抗凝和抗血栓、抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等作用，具有广泛的药理活性。临床用于温毒发斑,吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛【4】经，症瘕腹
痛，跌扑损伤，痈肿疮疡等症。
总之，在中医理论中白偏于补，赤偏于破，乃是赤白芍二药分用的基本特点。白芍常配伍白术补脾，同川芍泻肝，同人参补气，同当归补血，同甘草止腹痛，同黄连止泻痢。赤者常配伍犀角今以水牛角代凉血止血，同槟榔治五淋，同桅子泻肝火，同防风发痘疹，同天花粉祛癖生新。要在配伍之神，乃著奇绩耳。
4、现代分析方法
4.1高效液相色谱法
高效液相色谱法主要是利用芍药苷与其他组分在流动相与固定相中的分配系数不同而把芍药苷分离出来并进行含量的测定。芍药苷为亲水性化合物分离主要是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。
该法测定芍药苷的色谱条件中流动相以“甲醇-水”系统、“乙腈-水”系统以及“甲醇-异丙醇-醋酸-水”系统为主,且以“甲醇-水”系统最为常用，有的流动相加入一定的有机酸(如:乙酸、磷酸)是为了调节pH值,因为芍药苷呈弱酸性,加入一定的酸或缓冲溶液可减少拖尾,提高灵敏度,多少根据具体实验而定；检测波长多在230nm；流动相流速多在0.5～1.5ml/min之间,供试液的制备以甲醇溶液提取为主,乙醇也较常用,且常通过滤膜(0.45um)。
文献中记录用高效液相色谱法测定芍药苷含量的过程比我们在实验室的操作要严谨一些，文献中除了对照品溶液、供试品溶液、标准曲线的制备还会做精密度实验，精密量取对照品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,按已知色谱条件试验,重复测定6次,计算芍药苷峰面积积分值的RSD，考察仪器精密度。稳定性实验，取供试样品溶液分别在0h、2h、4h、8h、20h进样20μL，计算芍
药苷峰面积积分值的RSD，分析溶液的稳定性【6】
。重复性实验，取同供试药材样品6份,按供试品测定法测定,测得芍药苷的平均含量，计算RSD(n=6)，避免
偶【7】然误差。
最后还有加样回收率实验，取已知含量的供试品溶液5份，各1mL，分别加入每毫升含芍药苷50μg的芍药苷对照品溶液1mL，混匀，测定回收率。在有些处方中测定芍药苷的含量时还会做阴性对照实验，将处方中的芍药除去，提取其它药材，进样，阴性对照液则在相对应的保留时间内无吸收峰出。
高效液相色谱法具有适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分易收集以及安全等特点,应用范围非常广泛。
4.2薄层扫描法
薄层扫描法是先用薄层色谱法(TLC)将待测组分分离出来,然后利用薄层扫描仪在选定的波长范围进行扫描,得到面积积分值,再根据由标准液建立的回归方程算出含量,该方法准确、灵敏度高,应用较为广泛,但操作也较麻烦,尤其是测定复方中某一味组分的含量时,为避免其他组分干扰,往往需要作各种前处理,所受影响较大,重现性较差。扫描仪目前国内多用日本岛津双波长单光束薄层扫描仪；展开剂多用氯仿-甲醇系统；测定波长是芍药苷的吸收波长其数值各异,是因为不同的溶剂和其他成分对芍药苷的测定产生一定影响,而有一定的波动,有时为了避免其他组分的干扰,而不采取最大吸收峰,另取一峰值或其附近值；狭缝宽
度直接【8】
影响分光质量,一般以减少狭缝宽度时吸光度不再改变时的宽度为宜。
4.3分光光度法
分光光度法是定量分析中常用的方法,是利用分光光度计来测定芍药苷的吸光度,建立浓度C与吸光度A之间的正比关系A=K×C,来计算其含量。总体来说,分光光度法是经典的定量分析方法之一,但由于其操作繁琐,影响因素较多,灵敏度受到一定限制,应用不多。
4.4高效毛细管电泳法(HPCE)HPCE是继HPLC之后又一种重要的分离、分析及微量制备的新技术。其原理是利用离子在电场作用下,在毛细管中按其淌度和分配系数不同进行分离、分析。具有分离效率高、进样量少、最低检测量小、重现性好、柱子不污染、成本低廉等特点,近几年应用越来越广泛。
如王磊磊文献中报道利用高效毛细管电泳分析方法,建立赤芍和白芍的高效毛细管电泳法(HPCE)指纹图谱。方法HPCE工作条件:采用未涂层熔融石英毛细管(内径75μ
m,有效长度50cm),分离电压为25kV,柱温25℃,二极管阵列检测器(DAD)检测波长为220nm,缓冲液为30mmol/L硼砂(pH=9.0)溶液。按此条件对来自不同产地的7种赤芍样品和8种白芍样品进行了分析。结果建立了赤芍和白芍HPCE指纹图谱,采用中药指纹图谱相似度计算软件,以系统生成的对照指纹图谱为对照模板对不同样品的图谱进行相似度计算。
目前,芍药苷在复方中的定量分析方法主要有反相高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度法和毛细管电泳法等。薄层扫描法和分光光度法因操作繁琐、灵敏度不高、影响因素较多而应用较少；毛细管电泳法为一新兴分离、分析技术,应用前景广阔；反相高效液相色谱法以其高效、高速、仪器化等特点而应用最广。在查阅文献过程中还看到一篇采用竞争性酶
联免疫检测法（ELISA）对芍药中芍药苷（PF）和白花素（Alb）进行定量分析。介绍了一种对芍药进行质量控制的免疫化学方法，这种方法较新颖。竞争性酶联免疫检测法的原理:以测定抗原为例，（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。文献作者利用这一方法测定白芍苷的含量，测定结果与HPLC检测结果的一致性良好，共检测了15个方剂，竞争性ELISA的灵敏度比HPLC法高100倍。但是我觉得竞争性ELISA操作过于繁琐，与HPLC相比可行性差。而且个人觉得HPLC的灵敏度已经可以达到要求。
5、讨论
白芍与赤芍在化学成分、药理作用等方面都有差异，所以在临床应用上定要加以区别，不可以同作为一味中药使用。在芍药苷含量测定方面多采用HPLC法，该法测定操作简单、适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分易收集以及安全等特点,应用范围非常广泛。
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